Трансляции
  • Футбольные спонсоры
  • 16.05.2012 - Ученые по-новому наблюдают за ВИЧ

    Французские микробиологи разработали новую методику микроскопии, которая позволяет рассматривать отдельные вирусные частицы без нарушения жизнедеятельности инфицированных ими клеток, и использовали ее для изучения процесса заражения клетки ВИЧ.

    На сегодняшний день существует несколько видов микроскопов, позволяющих наблюдать и изучать устройство объектов микромира. Первые торшеры появились в конце 16 века и на несколько столетий стали основным инструментом биологов, изучающих живые организмы. Их разрешающая способность ограничена половиной длины самой короткой волны видимого света — примерно 200-300 нанометров. Этот предел препятствует изучению внутриклеточных процессов, так как большинство электронных микроскопов не способно работать с живыми клетками.

    Группа биологов под руководством Кристофа Циммера (Christophe Zimmer) из Института Пастера в Париже (Франция) преодолела это ограничение с помощью комбинации специальных меток из четырех аминокислот и молекул флуоресцирующих углеводов, свечение которых считывается специальным фотолокализующим микроскопом (PALM).

    Методика группы Циммера работает следующим образом. В геном изучаемой клетки или вируса вставляются короткие последовательности нуклеотидов, заставляющие ее вставлять в некоторые белки «хвосты»-метки из четырех аминокислот. Они не мешают жизнедеятельности, но при этом служат «якорем» для молекул флуоресцентного вещества, которое вводится в клетку или в питательную среду перед экспериментом.

    При наблюдении за клеткой PALM-микроскоп облучает ее короткими лазерными импульсами, которые включают и выключают случайное число молекул светящегося пигмента. Светочувствительные датчики фиксируют вылетевшие из клетки фотоны и специальный алгоритм «собирает» сверхчеткое изображение клетки по нескольким тысячам вспышек, которые были вызваны облучением лазера.

    Циммер и его коллеги адаптировали эту методику для наблюдения за ВИЧ, добавив аминокислотные метки в молекулы интегразы — специального фермента, «вставляющего» ДНК вируса в хромосому его жертвы. Каждая вирусная частица содержит от 100 до 200 копий этого белка, что увеличивает шансы на обнаружение каждого вируса в момент заражения клетки.

    Биологи подготовили раствор из частично собранных и полноценных частиц ВИЧ с вставленными аминокислотными метками и попытались рассмотреть их при помощи PALM-микроскопа. Методика оказалась вполне успешной — ученые смогли увидеть как небольшие шарики полусобранных вирусов диаметром в 50 нанометров, так и продолговатые конусы полных частиц ВИЧ длиной в 112 нанометров.

    Затем ученые приступили к наблюдению за частицами вируса в живой клетке. Для этого они вырастили небольшое количество помеченных «конусов» ВИЧ, заразили ими несколько иммунных клеток и наблюдали за этим процессом при помощи фотолокализующего микроскопа. За это время биологам удалось зафиксировать хронику заражения клетки и изучить этот процесс в динамике.

    Как и ожидалось, большинство частиц ВИЧ было сконцентрировано в районе оболочки ядра клетки — основной цели молекул интегразы и всего вируса в целом. По расчетам биологов, им удалось достичь разрешения в 30 нанометров, что в несколько раз лучше, чем разрешение лучших оптических микроскопов.

    Высокая разрешающая способность микроскопа позволила Циммеру и его коллегам проверить, сбрасывает ли вирус свою защитную оболочку — капсид — сразу после проникновения в клетку или же только при прикреплении к ядру. Многочасовые наблюдения за состоянием вирусов показали, что вирус сохраняет капсид до тех пор, пока он не достигнет ядра своей жертвы.

    Исследователи полагают, что их методика и результаты наблюдений помогут разработать эффективные методы борьбы с вирусом иммунодефицита человека и позволят лучше понимать процессы, протекающие внутри клеток.




    

    Написать комментарий